富灯网平台 Cell | 单细胞研究新突破：从“以测序为核心”到“以成像为引擎”！_技术_样本_下图

文章题目：STAMP: Single-cell transcriptomics analysis and multimodal profiling through imaging

发表期刊：Cell

影响因子：42.5

发表时间：2025年6月

研究亮点

单细胞转录组测序（scRNA-seq）在揭示细胞异质性方面具有革命性意义，但其高昂的成本、有限的通量和细胞破坏性的分析限制了其在大规模研究中的应用。为了克服这些挑战，西班牙国家基因组分析中心（CNAG）、圣犹达儿童研究医院和阿德莱德大学的联合研究团队推出了创新的STAMP技术（单细胞转录组分析及多模态成像谱）。这项突破性技术利用先进的成像平台，如Xenium、CosMx和MERSCOPE，实现了无需测序的单细胞多模态分析，能够同时检测RNA、蛋白质、细胞形态和结构。STAMP技术在一次实验中就能高效处理数百万细胞，将成本降低至传统测序方法的十分之一。 研究团队已经在多种样本类型中验证了STAMP技术的灵敏度和可扩展性，包括外周血单核细胞、癌症细胞系和干细胞。STAMP技术成功识别了超罕见的细胞群，例如免疫亚群和干细胞分化轨迹，并展示了其在临床样本（如前列腺癌FFPE组织）和高通量扰动实验（如免疫刺激响应）中的潜在应用。STAMP技术的问世不仅打破了传统测序技术的局限，还为构建大规模单细胞图谱和实现精准医疗提供了前所未有的工具支持。

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图 文章概览

研究设计

STAMP的核心流程分为四步：①细胞固定与锚定：通过化学固定保持细胞完整性，并将其单层排布于适配成像平台的载玻片；②多模态探针杂交：针对RNA（基因面板）和蛋白质（抗体偶联寡核苷酸）设计探针，通过循环成像解码；③高通量成像与数据采集：利用Xenium、CosMx SMI等平台进行全自动多轮成像，捕获转录本和蛋白信号的亚细胞定位；④数据整合与质控：结合细胞核（DAPI）和膜标记（CD298）进行分割，通过算法（如InSituType）去除低质量细胞，并整合RNA、蛋白及形态学数据构建多模态图谱。研究团队通过验证实验（如癌症细胞系混合样本、PBMC免疫激活扰动）证实了STAMP的高灵敏度（可区分100细胞级样本）和跨平台一致性（CosMx与Xenium的基因表达相关性达80%以上），并展示了其在干细胞分化轨迹推断和临床FFPE样本中的应用潜力。

研究结果

1.基于成像的无测序单细胞组学

研究团队突破性地开发了STAMP技术，这是一种创新的单细胞转录组分析与多模态成像方法。该技术通过将悬浮细胞固定并锚定在成像载玻片上，结合先进的转录组和蛋白质成像平台（如Xenium、CosMx SMI），实现了无需测序的单细胞多模态分析，涵盖RNA、蛋白质及H&E形态学。在验证实验中，研究者利用CosMx SMI平台（STAMP-C）对三种癌细胞系（LNCaP、MCF-7和SK-BR-3）的混合样本进行了分析。通过免疫荧光成像和细胞分割标记，成功区分了不同细胞类型，并在质控后保留了95.37%的高质量细胞。无监督聚类（InSituType算法）进一步识别出三个独立的细胞群，其转录谱与单细胞测序参考数据集高度一致，展现了STAMP技术的强大潜力。

图 通过成像进行免测序的单细胞基因组学

2.低细胞输入量的灵敏捕获

为了探究STAMP技术在极低细胞浓度条件下的效能，研究人员精心设计了一项实验。他们将MCF-7、SK-BR-3和LNCaP三种癌细胞混合，并以100至1000个细胞的不同数量固定在载玻片上（参见下图A）。实验结果显示，细胞回收率令人满意，达到了85.33%（下图B），且各细胞系的比例保持稳定，波动范围为18.6%至56.9%（下图C）。当细胞密度达到或超过500时，基因和转录本计数显示出良好的稳定性；然而，在100个细胞的样本中，检测效率有所下降（下图D、E）。值得注意的是，在高密度样本中，由于分割限制，细胞面积有所减小（下图F）。此外，基因表达分析显示，单个细胞与其对应的细胞核之间存在高度相关性（下图G），而技术重复性实验进一步验证了这些结果的可靠性（下图H、I）。

图 灵敏捕获低起始量细胞数

3.跨平台样本多重分析

STAMP技术在Xenium、CosMx和MERSCOPE等多种成像平台上均展现出卓越的性能。通过对27个样本（涵盖PBMC、干细胞和癌细胞等）进行深入的多重分析（参见下图A），研究人员发现基因表达、转录本计数和细胞面积在技术重复间显示出极高的一致性（如下图B所示）。跨平台的基因表达相关性显著，覆盖了18/21个样本（下图C），差异主要归因于不同检测面板的基因覆盖范围差异，重叠率为29.6%（下图D）。采用Harmony算法整合数据后，批次效应得到了有效消除（下图E），而局部逆辛普森指数（LISI）进一步证实了跨平台的一致性（下图F）。此外，通路分析结果，如Biocarta淋巴细胞通路在PBMC中的富集情况，进一步验证了生物学上的一致性（参见下图G和H）。

图跨平台样本多通路检测

4.百万级循环血细胞的免疫表型分析

STAMP技术在分析170万PBMCs方面取得了显著成果，如下图A-D所示。通过Xenium免疫肿瘤面板（涵盖380个基因），我们成功识别出13个关键免疫群体，包括髓系、T细胞和B细胞等（见下图B）。进一步应用Xenium Prime 5K面板后，我们的分辨率提升至31个不同的免疫细胞状态（下图C）。例如，CD4+ T细胞被细分为8个亚群，涵盖初始、效应、记忆以及Th1/Th2/Th17等多种类型；CD8+ T细胞则分为8个亚群，包括中央/效应记忆和干扰素响应型等；NK细胞也被精确区分为CD56dimCD16bright与CD56brightCD16dim两个亚群（下图D）。与单细胞测序技术相比，STAMP在靶基因检测的灵敏度上表现相当出色，尽管其全转录组覆盖范围略逊一筹。

图 数百万个循环血细胞的免疫表型

5. 免疫细胞扰动实验的多重分析

研究人员采用LPS（天然免疫激活剂）和抗CD3/CD28（适应性免疫激活剂）对PBMCs进行刺激，以验证STAMP在干扰研究中的应用价值（见下图E、F）。结果显示，在刺激作用下，初始CD4+ T细胞数量显著减少，而效应/耗竭型CD4+ T细胞则有所增加，尤其在24小时后表现更为明显。LPS能够激活单核细胞，并促使炎症因子如IL1B、IL6、CCL3等上调（参考下图F）。通过CellChat分析揭示了CXCL8/CXCR1作为细胞间通讯的关键途径。此外，差异表达基因与独立的单细胞测序数据集呈现出高度一致性。

图 评估STAMP在扰动研究中的适用性

6. 干细胞分化过程中的细胞状态动态分析

通过运用STAMP的先进多重能力，研究人员精确追踪了人胚胎干细胞（hESC）在BMP4刺激下的分化路径（如下图A–G所示）。从BMP4处理开始（0–120小时），细胞经历了从多能状态到中间状态（6–24小时）的转变，并进一步分化为中内胚层样（48小时）和羊膜样状态。到了72小时，中内胚层细胞进一步分化为中胚层（SNAI2、PDGFRA）、内胚层（CXCR4）和原始生殖细胞样（NANOG）；而羊膜样细胞则演化为更成熟的晚期状态（TGFBI）。轨迹分析工具Palantir揭示了多能基因表达的下调（例如SOX2）和谱系标记基因表达的上调（例如GATA3、EOMES）（如下图G），这些结果与单细胞测序数据相吻合，进一步证实了分化过程的动态变化。

图分析干细胞分化过程中的细胞状态动力学

7. 罕见细胞类型的灵敏检测

研究团队评估了STAMP技术在临床罕见细胞检测中的应用。他们模拟了CTC识别，将极低比例的MCF-7癌细胞混入PBMC样本，使用CosMx平台进行成像分析，并整合多重判别标准以精准识别CTC模拟细胞。在不同掺入量的子样本中，成功识别出CTC模拟细胞，部分样本回收率超过100%。通过免疫荧光成像坐标定位验证了识别结果的准确性。此外，在Xenium平台上使用免疫肿瘤面板对PBMCs样本进行分析，证实了STAMP技术在极低丰度细胞检测中的鲁棒性。

图 循环肿瘤细胞模拟和多模式分析

8. RNA与蛋白质多模态整合分析

研究人员巧妙地将RNA（Xenium平台）和蛋白质（CosMx SMI、PhenoCycler Fusion平台）数据进行了无缝整合，如图6F-J所示。蛋白质检测展现出卓越的稳定性，平均荧光强度分别达到STAMP-CP的1,430.7和STAMP-X-CP的2,022。令人瞩目的是，单模态与多模态工作流在蛋白质表达方面显示出极高的相关性（R=0.93，p<0.01；）。多模态聚类技术成功区分了主要的免疫细胞类型，尽管蛋白质面板规模有限，这在一定程度上影响了亚群分辨率的精确度。

9. 解离组织的STAMP分析

研究者通过分析小鼠五类器官的解离细胞和细胞核，验证了STAMP技术在复杂组织样本中的适用性。使用Xenium Prime 5K小鼠全组织与通路面板，对601,417个细胞/细胞核进行分子特征分析，发现：

细胞与细胞核的高质量比例、转录本及基因检测数量相当，基因表达高度相关（R=0.73, p<0.01）。 肝脏样本因组织复杂性和解离过程中高活性酶的影响，细胞数据出现显著偏差；脑组织中细胞核分析优于全细胞。 成功鉴定出44种细胞类型，肺组织展现出最高细胞多样性。 在五器官混合样本中，通过器官特异性基因标志的计算分配，实现了细胞来源的准确分离。 差异表达分析进一步验证了标志基因的器官特异性。 这些发现证实了STAMP技术在复杂组织样本中的有效性和准确性。

图用STAMP分析解离的组织

研究讨论与总结

STAMP技术开启了单细胞分析的新时代，具备高通量、多模态兼容性和成本效益，使得大规模临床研究成为可能。该技术已成功解析750万PBMCs，细分31种免疫亚群，并揭示CD4+ T细胞的全谱系动态。在干细胞分化研究中，STAMP结合伪时间分析，精确追踪了干细胞分化轨迹。此外，STAMP可直接与临床病理流程对接，支持形态-分子双重诊断。尽管基因面板覆盖有限（最高6,000基因），依赖预设计探针限制了全转录组探索。未来优化探针设计和结合空间转录组技术有望拓展其应用。STAMP突破了现有技术局限，为精准医疗提供可扩展方案，在罕见病细胞鉴定、药物筛选、肿瘤微环境解析和个体化治疗等领域具有重塑生物医学研究范式和推动临床整合的潜力。

发布于：上海市

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